CH
3
OH
OH
O
O
O
CH
3
T o
ACID
4-HYDROXY-DECANOIC
GAMMA-DECALACTON
1.3. [R]- γ-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng
Các γ-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó
γ-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất. γ-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong
quả đào và một số loại hoa quả khác. γ-Decalactone là một ester nội phân tử
của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ
70-100
0
C sẽ đóng vòng để tạo γ-decalactone [7].
Ở điều kiện thường γ-decalactone là một chất lỏng trong suốt không
màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu.
Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl
acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]:
+ Công thức phân tử: C
10
H
18
O
2
(M=170)
+ Công thức cấu tạo:
+ nhiệt độ sôi: 281
0
C
+ Tỷ trọng : 0,952
+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa.
γ-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực
phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách
những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao
nhất từ 5 –20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng
trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400
ppm[17]. Trên thế giới γ-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công
5
nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an
toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất
tạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa,
sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]
Trong tự nhiên, γ-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như:
mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20
mg/kg một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử
γ-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự
nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là
[R]-γ-decalactone và [S]-γ-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang
học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt
trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5].
1.4. Tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật [15].
γ-Decalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học
(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi
sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp
γ-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp
sinh học.
1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic).
Là con đường tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không
sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp
γ-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát
hiện ra sự có mặt của γ-decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi
các chủng Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc
tổng hợp γ-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng
γ-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng
6
Sporobolomyces odorus để tổng hợp γ-decalactone nhưng chỉ thu được
1mg/1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản
xuất γ-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên
có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc
sinh lý học với tổng hợp γ-decalactone.
1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation)
γ-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp
bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ
vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-
decanoic sau đó đóng vòng để tạo ra γ-decalactone .
Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo
γ
-decalactone ở vi sinh vật.
Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay
không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp
γ-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy
mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11,
12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển
hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm
cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất γ-decalactone
và một số lactone khác[8, 10, 12, 16, 19].
7
CH
3
OH
O
OH
CH
3
O
OH
OH
CH
3
O
O
Vi sinh vËt
Acid 4-hydroxy decanoic
Acid ricinoleic
Gamma-decalactone
Năm Chủng vi sinh vật Nguyên liệu Sản phẩm
198
0
Pityrosporum canis
Pit.achydermatis
Pit.orbiculare
Pit.ovale
Acid oleic
γ-decalactone
γ-hexa
γ-hepta
1982 Aspergillus oryzae
Geotrichum klebahnii
Yarrowia lipolytica
Candida guilliermondii
Candida albicans
Candida krusei
Candida parakrusei
Candida pseudotropicals
Candida stellatoidea
Candida tropicalis
Candida rugosa
Hansenula saturnus
Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu thuỷ
phân
Acid ricinoleic
γ -decalactone
1989
Aspergillus niger
Cladosporium suaveolens
Phanerochaetechrysosporiu
m
Pichia etchellsii
Dầu thầu dầu
Dầu hướng dương
Dầu dừa
γ-decalactone
γ-octanolied
γ-decanolied
1990 Sporobolomyces odorus
Rhodotorula glutinus
Dầu thầu dầu
γ-decalactone
γ-hydroxy-
decanoic acid
2001
Yarrowia lipolytica
HR 145 (DSM 12397)
Dầu thầu dầu
γ-decalactone
1.4.3. Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone ở vi sinh vật.
Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là
qúa trình β-oxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase
8
(Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-
CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế
bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2].
Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã
biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra γ-decalactone. Yves Wache
[21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5)
được mã hoá bởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có
liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá
enzym Aox3 (chuỗi ngắn-short chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng
hợp γ-decalactone. Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng
γ-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/l
lên đến 220mg/l sau 24 h). Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-γ-
decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng
ở chủng hoang dã quá trình β-oxy hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl-
Coenzym A Hydrogenase.
9
Con đường
β
-oxy hoá biến đổi methyl ricinoleate ở nấm men Yarrowia
lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [22]:
Sản phẩm β-oxy hoá khác
PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả
+ Sản phẩm tạo thành:
1: Dec-3-en-4-Olide
2: γ-Decalactone
3: Dec-2-en-4-Olide
4: 3-hydroxy-γ-Decalactone
5: 3-keto-γ-Decalactone
+Hệ enzym:
Aox: Acyl CoezymA oxidase
Ahy: Acyl Co A Hydratase
Hdh: 3-hydroxy-γ-Decalactone
Thi : 3keto acyl Co A thiolase.
10
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị
• Dầu thầu dầu : Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công
nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng
ở Bắc Ninh.
• Acid ricinoleic : Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp
• Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện
CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu,
chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica ), chủng PDT7.
• Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa
được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên
Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây…
• Hoá chất :
+ Etyl acetat (Trung Quốc)
+ Agar
+ Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco)
+ Dịch chiết Malt-glu 20
0
Bx
+ (NH
4
)
2
SO
4
+ n-Hecxan ( Trung Quốc)
+ γ-Decalactone chuẩn
+ HCL 37%
• Thiết bị và dụng cụ:
+ Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp )
+ Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật )
+ Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật )
+ Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ )
11
+ Máy ly tâm Universal 16 Hettich
+ Lò vi sóng LG ( Hàn Quốc )
+ Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật )
+ Máy sắc ký khí Aligent 6890 A(USA)
+ Đĩa petri, ống eppendorf, ống nghiệm có nắp vặn, ống falcon, pipet,
bình tam giác…
2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu
• Môi trường 1:
+ Chất khoáng (*) : 100 ml
+ Nguyên tố vi lượng (**) : 200 µl
+ Dịch chiết nấm men 5 % : 2 ml
+ (NH
4
)
2
SO4 : 5 g
+ Thêm nước vừa đủ : 1lit
(*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit)
KH
2
PO
4
: 850 mg
K
2
HPO
4
: 150 mg
MgSO
4
.7.H
2
O : 500 mg
NaCl : 100 mg
CaCl.6.H
2
O : 100 mg
(**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit)
H
3
BO
3
: 500 µg
CuSO
4
.5.H
2
O : 400 µg
KI : 100 µg
FeCl
3
. 6 H
2
O : 200 µg
12
MnSO
4
.4H
2
O : 400 µg
Na
2
MoO
4
.2H
2
O : 200 µg
ZnSO
4
.7H
2
O : 400 µg
• Môi trường 2: môi trường yeast-nitrogen 10%
+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco
gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát
triển của nấm men.
• Môi trường 3:
+ Pepton 2g
+ Dầu thầu dầu 10g
+ Tween 80 20 µl
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
• Môi trường 4:môi trường làm sạch lần một:
+ Dịch Malt –gluco 20
0
Bx : 100 ml
+ Agar : 20g
+ Nước cất vừa đủ : 1lit
Hấp ở 120
0
C/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80
0
C bổ xung 0,1 % acid
lactic và đổ thạch đĩa.
• Môi trường 5: môi trường làm sạch lần 2
Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acid
lactic.
• Môi trường 6: môi trường phân lập và giữ giống
13
Thành phần như môi trường làm sạch lần 2.
2.1.3 Phương pháp thực nghiệm
• Phương pháp phân lập nấm men sử dụng Ricinoleic acid :
+ Nguyên tắc:
Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi
sử dụng môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic. Nếu nấm
men mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá được acid ricinoleic. Những chủng có
khả năng chuyển hoá acid ricinoleic được kiểm tra khả năng tạo mùi thông
qua đánh giá cảm quan.
+ Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường 1 đong vào các ống nghiệm
loại 10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml. Bổ xung 30 µl acid ricinoleic / ống.
Hấp thanh trùng ở 120
0
C / 20 phút.
+ Lấy mẫu:
- Mẫu đất: Dùng dụng cụ vô trùng lấy đất trên bề mặt vào bình thuỷ
tinh vô trùng.
- Lá và hoa: Được lấy vào túi ni long sạch.
+ Xử lý mẫu:
- Dùng kéo đã thanh trùng cắt nhỏ khoảng 2 g lá cây (1cm) và cho vào
ống falcon chứa 20 ml nước cất vô trùng (Với mẫu đất cho khoảng 4 gam).
- Lắc nhẹ và ngâm khoảng 10 phút.
- Lắc mạnh trong 1-2 phút.
- Để lắng trong vài chục giây, sau đó hút 1 ml dung dịch vào ống
eppendorf.
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét